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探針設(shè)計(jì)的原則具體體現(xiàn)如下:
1. 先選擇好探針,然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針。
2. 所選序列應(yīng)該高度特異,盡量選擇具有最小二級結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段——這是因?yàn)槎壗Y(jié)構(gòu)會影響反應(yīng)效率,而且還會阻礙酶的擴(kuò)增。建議先進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)檢測,如果不能避免二級結(jié)構(gòu),那么就要相應(yīng)提高退火溫度。
3. 擴(kuò)增長度應(yīng)不超過400bp,理想的擴(kuò)增長度在100-150bp內(nèi),擴(kuò)增片段越短,有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片段也容易保證分析的一致性。
4. 保持GC含量在20%和80%之間,GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng),從而會導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低,以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號。
5. 為了保證效率和重復(fù)性,應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列,尤其是G(不能有4個連續(xù)的G) 。
6. 將引物和探針互相進(jìn)行配對檢測,以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。
在原理上與引物設(shè)計(jì)是比較類似的。只是因?yàn)樘结樞蛄幸笃ヅ涠群芨?,所以對于探針的GC含量和Tm值都是有嚴(yán)格要求的,而且還要考慮到與上下游引物相匹配。假如你手頭已經(jīng)有了染料法的引物,然后想仍然使用這一對引物、在這一對引物對應(yīng)的序列中間選一段作為探針可以嗎?我們不建議這么做。因?yàn)槟銌为?dú)設(shè)計(jì)的上下游引物沒問題,單獨(dú)設(shè)計(jì)的探針看起來也沒問題,但把引物與探針放在一起,就有可能出現(xiàn)參數(shù)不兼容的問題。所以還是三者放在一起設(shè)計(jì)才好。