商品屬性：

描述：本試劑盒所包含的原核表達(dá)載體(pCold-SUMO-10His)是在 pCold-SUMO 載體基礎(chǔ)上改造而成，

該載體啟動子(CS Promoter)來源于南極嗜冷細(xì)菌，在低溫下(15 度)才能啟動蛋白的表達(dá)。低溫下細(xì)菌生長緩慢，使得蛋白合成速度減慢，從而最大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率，提高了蛋白可溶性表達(dá)，增強了活性蛋白的表達(dá)比率。該表達(dá)系統(tǒng)所包含的 SUMO tag 可以極大地提高小分子量蛋白的表達(dá)量，而且進(jìn)一步提高了蛋白的可溶表達(dá)幾率。同時，TEE 信號肽可增強冷啟動子調(diào)控下目的蛋白的高表達(dá)。
改進(jìn)后的 pCold-SUMO-10His 載體，其 SUMO 蛋白標(biāo)簽含有 10 個組氨標(biāo)簽（10His tag），使其結(jié)合 Ni-NTA 的能力更強。與較早版本的 pCold-SUMO 表達(dá)系統(tǒng)相比，pCold-SUMO-10His 表達(dá)系統(tǒng)在保留了原有統(tǒng)的蛋白可溶性能生產(chǎn)能力、高特異性剪切能力的情況下，對 Ni-NTA 結(jié)合能力的得到明顯提高。其對 Ni-NTA 結(jié)合能力的提高，

在以下三個方面改善了生產(chǎn)重組蛋白的性能：

（1）提高了粗蛋白樣品中目標(biāo)蛋白的捕獲能力，從而提高純化產(chǎn)量；

（2）在蛋白純化過程中可以
使用更高濃度的咪唑進(jìn)行漂洗，去雜蛋白的能力明顯提升，從而獲得更高純度的重組蛋白；

（3）在重組蛋白酶切去除 SUMO標(biāo)簽后，利用 Ni-NTA 去除 SUMO 標(biāo)簽更為，獲得純度更高的無標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)蛋白。
關(guān)于宿主菌的使用：本試劑盒配備了兩種宿主表達(dá)菌感受態(tài)細(xì)胞，Lyophilized Arctic (DE3)感受態(tài)和 LyophilizedBL21(DE3) Chaprone 感受態(tài)，兩種感受態(tài)均為凍干品形式可長期保存在-20℃，效價無明顯下降（2~10X10e5 cfu/μg）。
通常在質(zhì)粒載體的構(gòu)建完成，并測序驗證后，可將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入該感受態(tài)進(jìn)行蛋白表達(dá)。該宿主菌僅為蛋白表達(dá)生產(chǎn)用，不可以進(jìn)行載體構(gòu)建和質(zhì)粒的提取制備。由于 pCold-SUMO 系統(tǒng)的高可溶性表達(dá)特性，在大多數(shù)情況下重組蛋白在 LyophilizedArctic (DE3)感受態(tài)即可獲得理想的可溶表達(dá)，因此實驗請選用 Lyophilized Arctic (DE3)感受態(tài)宿主菌。

在 LyophilizedArctic (DE3)感受態(tài)宿主菌可溶表達(dá)效果不理想的情況下，再選用操作相對復(fù)雜的、帶有輔助折疊伴侶分子的 LyophilizedBL21(DE3)Chaprone 宿主菌，該系統(tǒng)可獲得最佳的可溶表達(dá)。除此外，pCold-SUMO 系統(tǒng)在常規(guī) BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌內(nèi)均可獲得可觀的可溶性表達(dá)。
關(guān)于蛋白酶的使用：試劑盒配備了 SUMO 蛋白酶（酵母來源，也稱為 UIP 蛋白酶）和 rTEV 蛋白酶，在第一步載體構(gòu)建過程中需要評估、考慮兩個蛋白酶的使用策略。SUMO 蛋白酶識別蛋白結(jié)構(gòu)，切割活性高、酶切，對于需要去除 Tag的重組蛋白其是。個別情況下 SUMO 標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)會受到 C 端重組目標(biāo)蛋白的影響，使得 SUMO 蛋白酶對重組融合蛋白的切割效率降低、甚至是無效，此時再選用 rTEV 蛋白酶進(jìn)行酶切。由于 rTEV 蛋白酶識別氨基酸序列，個別重組融合蛋白會包埋識別序列，因此也會導(dǎo)致蛋白酶切效率下降。由于重組融合蛋白結(jié)構(gòu)的無法預(yù)測性，因此在實驗過程中兩種蛋白酶的酶切均需要測試。無論如何，通常 SUMO 蛋白酶具有更高的效率。本試劑盒配備的 SUMO 蛋白酶可以識別 SUMO標(biāo)簽結(jié)構(gòu)（SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG）切割位點位于 QIGG 之后。SUMO 蛋白酶含有雙 His 標(biāo)簽，保證了 SUMO 蛋白酶高親力的結(jié)合 Ni-NTA，以最大限度的去除 SUMO 蛋白酶（分子量約 26kD）。rTEV 蛋白酶可以識別 SUMO 標(biāo)簽后面的 Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列，并在識別位點 Gln-Gly(QG)之間進(jìn)行切割，從而去除 SUMO 標(biāo)簽。rTEV 蛋白酶含有 6XHis 標(biāo)簽（分子量約 30kD），可使用 Ni-NTA 純化介質(zhì)去除。
本試劑盒配備的 pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 為蛋白表達(dá)陽性質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有 43kD 的目標(biāo)蛋白，其與SUMO 標(biāo)簽（19kD）融合后分子量約為 62kD。該表達(dá)質(zhì)粒在 Arctic (DE3)中即可獲得良好的表達(dá)。其可以僅可做為表達(dá)、酶切實驗的陽性對照品。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結(jié)合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進(jìn)行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：