商品屬性：

描述：生產的大腸桿菌蛋白提取液采用的中性裂解 配方，從而最大限度的提高了后續(xù)提取蛋白的活性。使用該 溶液從大腸桿菌中提取蛋白不需要超聲波破碎等復雜的操 作步驟，溶液置于 4°C 可長期保存，使用方便。該溶液室溫 30min 可破碎 95％以上的細胞，裂解后的溶液可直接通過 Ni-NTA 等純化填料進行蛋白純化。該溶液既可適用于小量 蛋白表達檢測，也適用于大量蛋白的表達純化試驗；既適用 于純化可溶型蛋白，也適用于純化包涵體蛋白。
主要特征
? 單組分溶液，使用方便
? 裂解迅速，蛋白不會變性
? 適用于小量或大規(guī)模蛋白表達
? 適用于可溶性蛋白和包涵體純化
應用：大腸桿菌的裂解和包涵體純化。
儲存：置于 4°C 可保存 2 年。
操作方法
? 可溶型蛋白操作方法（1 ml 菌液為例）
1. 8,000rpm 室溫離心 3min 后，棄上層培養(yǎng)基，留取管底部菌體（盡量棄除掉培養(yǎng)基）。
2. 加入 200 μl（重懸體積不得少于 50 μl）大腸桿菌蛋白提取液重懸菌體，用吸頭吹打至無可見細胞團塊。
注：為降低溶液粘度，可加入 Benzonase 核酸內切酶至 0.25U/μL；加入終濃度為 1 mg/ml 的溶菌效果更佳。
3. 置于室溫孵育 30-60min，期間輕彈離心管數次以加速裂解。
4. 裂解完成后 13,000rpm 于 4℃離心 15-20min，將上清轉移至新的容器中，溶液可直接進行下一步純化或檢測試驗。
? 包涵體蛋白操作方法
5. 上述步驟 4 中，棄上清，保留沉淀組分，用 200 μl 的大腸桿菌蛋白提取液重懸沉淀。
6. 加入溶菌至終濃度 1 KU/ml，混合均勻，室溫孵育 10min。
7. 加入 800 μl 的滅菌水混合均勻。
8. 13,000 rpm 室溫離心 15-20min，棄上清后用 900 μl 滅菌水重懸沉淀，然后加入 200 μl 大腸桿菌蛋白提取液，混合均勻。
9. 13,000rpm 室溫離心 15-20min，重復步驟 8 三至五次。
10. 將沉淀溶解于變性溶液中，進行下一步純化或復性試驗。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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